多肽修饰: 生物素化

亲和素与生物素之间非常稳定的、非共价作用在化学和生物学领域是 常运用的工具之一。生物素是复合维生素B2的组成部份。它与鸡清蛋白、亲和素、真菌蛋白、链霉亲和素均有较高亲和性和结合力。亲和素和链霉亲和素都是四聚体蛋白，可紧紧地结合四分子D-biotin，其结合力是已知自然界中 强的非共价作用（Kd = 10-15 M)。

生物素与亲和素之间的相互作用可用于蛋白纯化、检测、固化、药物导向、蛋白质结构分析等。

多肽和蛋白的相互作用

  检测与某一多肽相互作用的物质， 简单的方法就是利用此多肽做亲和pull-down实验，然后直接检测结合蛋白。蛋白质体外结合(Pull-down)试验可用于验证蛋白-蛋白相互作用的存在（经由别的研究方法预测过的，如免疫共沉淀）和作为一种初级的筛选试验来识别一些未知的蛋白-蛋白相互作用。通过竞争性阻断结合，合成肽通常被用来验证被假设的蛋白质-蛋白质相互作用。

生物素标记肽含有一个特殊的功能区和相当于参照的未修饰肽，此肽可被锚定在亲和素共轭的磁珠上，将这些磁珠与目标样本共同孵育（如核提取物或纯化的重组蛋白），通过洗涤去除未结合的蛋白，然后洗脱结合的蛋白质， SDS/ PAGE分析，经蛋白染色即可直接观察。通过比较分别与修饰和未修饰多肽相结合的蛋白质，即有可能确定候选者，即特定功能蛋白的“reader”蛋白。

带有一些特殊修饰的生物素标记肽可以通过化学合成，纯度达80％以上。肽长度应该在15-20个氨基酸。目标修饰位于序列中间时，两翼氨基酸残基不能少于6-8个。一般情况下，生物素多被偶联在N末端或C末端。如果无特殊要求，我们建议生物素偶联至N-末端，其优势是修饰的成功率更高，生产的时间更短，并且易于操作。此外，如果偶联至C-末端，需要额外增加一个赖氨酸。

生物素标记肽的Pull-down实验方案

  生物素标记肽可与亲和素磁珠共轭以生成树脂，用于肽pulldown试验。先把生物素标记肽上样至Immobilized streptavidin beads (Pierce) 锚定有亲和素的磁珠上，再与细胞裂解液孵育。细胞裂解于1％（v/v）Nonidet P-40, 150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, protease inhibitors (Complete Tablets, Roche Applied Science), 加入 1 mM sodium orthovanadate作为磷酸酶抑制剂。等量的蛋白质分别与被锚定的多肽在4℃孵育6小时。经过大量洗涤，在SDS样品buffer中煮沸，结合蛋白可从被锚定的多肽洗脱下来，或者，用50 mM dithiothreitol将多肽与蛋白复合物从磁珠中断开。将来自活性肽和对照目标肽pull-downs的洗脱液合并，以作进一步的分析。

  上图为链霉亲和素-生物素键力测量示意图。由于它们异常高的亲和结合性，其中 突出的配体-受体对是链霉亲和素-生物素（streptavidin-biotin）和亲和素-生物素（avidin-biotin）。 这两种蛋白质都有一个四聚体的结构，这样他们可以结合4个配体。

知识背景介绍

  L ifeTein可为您的蛋白与蛋白相互作用研究提供生物素标记肽合成服务。通常，生物素可被标记在N端或C端(经由Lys)。我们推荐N端标记，其标记的成功率更高，所需时间更短，操作更简洁。多肽都是由C端向N端合成。在SPPS合成草案中，N端修饰是其 后一步，不再需要其他特别连接步骤。相反，C端修饰不仅需要额外的步骤，而且过程更复杂。但是，理论上，生物素化可被定位在任何位置。

生物素可通过各种不同的linker或spacers与多肽隔离。一般建议引入间隔器如Ahx（一个6碳链接器)让生物素更稳定或更灵活。

·源肽生物提供N端或C端生物素标记：Biotin (N terminus), Lys(Biotin)(middle), Lys(Biotin)(C terminus)。

·带有linker(Ahx)的生物素化: Biotin-Ahx (N terminus), Lys(Ahx-Biotin)(middle), Lys(Ahx-Biotin)(C terminus)。

蛋白研究领域的应用

  在许多蛋白研究领域中，生物素标记肽通常与亲和素结合而被检测或纯化：: 免疫印迹（WB）、ELISA、免疫沉淀 (IP)、,多肽亲和纯化、免疫组化 (IHC)、细胞表面标记、流式细胞术/荧光激活细胞分类(FACS)。

  ·锁定蛋白或其他蛋白复合物，使用生物素化多肽作为诱饵可从某样品中捕获某一假定的结合成份。其中一个策略就是使用链霉亲和素一步法捕获体内生物素化蛋白和串联亲和纯化，即传统亲和标签（FLAG或6HIS）外加一个生物素多肽。

· 首先将生物素标记肽固化在亲和支撑材料上，例如亲和琼脂糖。

· 与固相载体一起孵化天然样品。

· 洗掉固相载体中未结合的样品成份。

· 通过改变缓冲液条件来洗脱目的分子及其关联蛋白。

· 生物素-亲和素的亲和力越高，对洗脱条件的要求越严。这一特点将有效减少其他亲和标签或天然抗体的背景结合。所以它很方便地用来确定两个纯化蛋白质在各种缓冲液中的相互影响（结合）能力。

仅有很少的天然生物素蛋白。所以交叉反应的机率非常低。生物素酰化从而可以用来从细胞裂解液中获得蛋白质相互作用信息