一、二硫键反应条件选取

二硫键就是指蛋白质或多肽分子结构中两个不同位点Cys的巯基（-SH）被氧化所产生的S-S共价键。一条多肽链上不一样的位置的氨基酸中间所产生的二硫键，能够把多肽链折叠成特定的空间分布。多肽分子一般来说分子量很大，空间分布繁琐，结构中产生二硫键时需要两个半胱氨酸在空间距离上非常接近。另外，多肽结构中还原态的巯基化学特性活跃，很容易出现其它的副作用，同时肽链上其余侧链也可能会出现许多修饰，所以，多肽链采取修饰所选择的氧化剂和氧化条件是反应的重要因素，反应原理也较为复杂，既有可能是自由基反应，也有可能是离子反应。

反应条件有许多种选择，例如空气氧化，DMSO氧化等温和的氧化过程，或H2O2，I2，汞盐等剧烈的反应条件。

1、空气氧化法：

空气氧化法生成二硫键是多肽合成中最具代表性的办法，一般是将巯基处在还原态的多肽溶解于水里，在近中性或弱碱性环境下（PH值6.5-10），反应24个小时以上。为了降低分子相互间二硫键产生的可能性，这种方法往往需要在较低浓度的环境下完成。

2、碘氧化法：

将多肽溶解于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘来进行氧化，反应15-40min。当多肽链里面含有对碘特别敏感的Tyr、Trp、Met和His的残基时，氧化条件要非常精准，氧化完成后，立即加入维生素C或硫代硫酸钠清除过多的碘。

二、两对及多对二硫键成环对策

当序列中含有两对或多对二硫键想要成环时，一般会有自然随机成环和定点成环两种情况：

1、自然随机成环指序列当中的Cys相互间随意成环，与一对二硫键成环条件差不多；

2、定点成环指序列当中的Cys根据设计要求产生二硫键，反应过程相对来说比较复杂。在固相合成多肽前，需提前制定几对二硫键生成的顺序和方法路经，选择适合的侧链巯基保护基，凭借其特性的差异，逐步氧化生成两对或多对二硫键。一般采用的巯基保护基有trt,Acm,Mmt,tBu,Bzl,Mob,Tmob等基团。

相对于二对及多对二硫键成环的多肽，在制定好二硫键生成次序及Cys侧链保护对策后，对于每一对二硫键成环后，都会取少部分树脂切割，并且对切割后产品实施MS检验。