具体的设计规则:

长度：合成的PNA序列一般不超过18个碱基，但不包括连接物、氨基酸和标记物。

含有氨基酸：一个赖氨酸或半胱氨酸可以连在一个序列的N或C端。

嘌呤含量：富含嘌呤的PNA容易聚合，水溶性差。为了避免聚合,请遵循以下原则:

1. 将嘌呤含量限制在60%以下

例如:

GAT TAG CAG TCT ACG(可行-嘌呤含量<60%)

2. 连续嘌呤不超过4个，鸟嘌呤不超过3个。

例如:

ATT AGG GGC ATC TAC (不可行- 连续 4 个 G)

CTA GAT AGA AGG TTC (不可行- 连续 6 个嘌呤)

3.如果不能避免上述规则，则可以考虑探针互补链。

例如:

GTA GAT GCC CCT AAT (可行-上面序列的互补序列，未违背任何准则)

GAA CCT TCT ATC TAG(可行-上述序列的互补序列)

避免自我互补序列：反向重复序列、发夹序列和回文序列。由于PNA/PNA相互作用比PNA/DNA更强，这些类型的探针容易聚合。

1. 四碱基互补是可行的，除了那些只包含C和g的。但是，当它们被一个或多个碱基分开时，这也是可行的。

例如:

GAT AATT GCA(可行-四个碱基互补)

GAT CCGG TAC(不可行-只有CCGG互补)

TAT CCT GGT A(可行，CC和GG隔一个碱基)

2. 六个或六个以上的碱基互补是不可行的。

例如:

CTA TTA ATG CA(不可行- 6个碱基互补)

3.当被一个或多个碱基分开时，除了只包含C和G的碱基外，可以补充六个碱基。

例如:

AGT GCT ACT(可行-中间有间隔)

GCG GCT CGC(不可行-只有G和C互补)

4. 即使被一个或多个碱基隔开，8个碱基互补也是不可行的。

例如:

ACTG T CAGT(不可行- 8碱基互补)

一般规则:

我们强烈建议您设计一个反平行PNA探针。PNA可以在任意方向形成双链，但采用反向平行以优先，形成最常见的双链。对于反义和DNA探针类型的应用，反平行性是最首选的构象。反平行取向时，PNA探针的n端相当于DNA的 5’端。

PNA的熔点与DNA的熔点不同。由于PNA链是不带电的，PNA- DNA的T m值会高于相应的DNA-DNA的T m值。一般来说，100 mM NaCl中碱基每增加一个，其T m值增加约1°C。盐浓度越低，T m值的差异越明显。一般来说，有10个碱基的PNA其T m值在50℃左右，含15个碱基的PNA其Tm值约为70℃。

长度为12~17个碱基的PNA序列效果最好。序列长度取决于其特定的应用。PNA探针序列的长度比DNA需要的短。具有链长的PNA倾向于按照序列聚合，它不容易纯化和表征。然而，序列越短，特异性越差。因此，对于短序列，不匹配的影响更大。